Ecotoxicology and Environmental Safety 44, 73 - 80 (1999)
Environmental Research, Section B
Article ID eesa. 1999. 1816,
verfügbar online bei http://www.idealibrary.com/

Risikoanalyse
von Microcystin in Nahrungsergänzungsmitteln
mit Aphanizomenon flos-aquae
David J. Schaeffer, Phyllis B. Malpas und Larry L. Barton

*Department of Veterinary Biosciences, University of Illinois, 2001 South Lincoln Avenue, Urbana, Illinois 61802; und Department of Biology, University of New Mexico, Albuquerque, New Mexico 87131

Eingegangen am 17. Mai 1999

Aphanizomenon flos-aquae, eine Cyanobakterie, die als Naturkostergänzung vermarktet wird, wird von natürlichen Vorkommen im Klamath See (Oregon) geerntet, die gelegentlich eine Verunreinigung durch Microcystis aufweisen. Die zuständige Behörden verschiedener Staaten entwickeln Vorschriften, um die im Trinkwasser und in verschiedenen, darunter aus A. flosaquae hergestellten Produkten enthaltene Microcystinmenge zu kontrollieren. Die Vorschriften für Microcystin (MC), ein Toxin, das von der Spezies Microcystis produziert wird und potentiell in natürlichen Vorkommen von A. flos-aquae enthalten ist, sollten sich auf Untersuchungen stützen, in denen eine Test Spezies einer natürlichen Mischung dieser Cyanobakterien ausgesetzt wird. Ein 1984 durchgeführter Versuch zur Bestimmung der Auswirkung von hohen A. flos aquae Futteranteilen auf die Vermehrung und Entwicklung von Mäusen wird hier noch einmal untersucht im Lichte von kürzlich durchgeführten Analysen des Microcystin-LR (MCLR) Gehaltes im Futter dieser Mäuse. Junge erwachsene Mäuse, die pro Tag bis zu 333 µg MCLR pro kg Körpergewicht konsumierten, zeigten keine negativen Wirkungen in Bezug auf Wachstum und Vermehrung, in Bezug auf fötale Entwicklung, Überleben und Organgewicht von Neugeborenen. Basierend auf einem NOAEL von täglich 333 µg MCLR pro kg Körpergewicht, einem Sicherheitsfaktor von 1000, wird für einen 60 kg schweren Erwachsenen bei einem Verzehr von 2g A. flos-aquae pro Tag der zulässige Höchstwert von MLCR als Schadstoff in A. flos-aquae Produkten auf 10.0 µg MCLR/g berechnet.

Schlüsselwörter: Aphanizomenon flos-aquae; Cyanobakterien; Mäuse; Microcystin; NOAEL; Risikoanalyse.

NOAEL: No Observed Adverse Effect Level (Grenzwert, bis zu dem keine schädliche Auswirkung beobachtet wurde)

Einleitung

Cyanobakterien, früher blau-grüne Algen genannt, haben als Nahrungsmittel eine lange Geschichte. Die Azteken in Mexiko ernteten natürlich gewachsenes Spirulina und trockneten es zu einem Brot, das sie Tecuitlatl nannten, was wörtlich "Steinexkrement" (Ciferri, 1983; Farrar, 1966) bedeutet. Natürlich wachsendes Spirulina wurde auch im Kanem Gebiet am Chad-See benutzt, wo es geerntet, durch Sand gefiltert und von der Sonne zu "Dihe" genannten Fladen getrocknet oder als "Biri" genannte Sauce zubereitet wurde (Clement, 1975).
Die Entwicklung der Phycotechnologie führte zu einem Massenanbau und einer Massenernte von Spirulina und Chlorella und ist inzwischen zu einer weltweiten Multimillionen Dollar Industrie geworden. Mit der Entwicklung neuer Quellen von einzelligem Protein (EZP) veröffentlichten die Vereinten Nationen Richtlinien für die Testverfahren von EZP vor der Verwendung als Nahrungsquelle für den Menschen (PAG, 1974, Becker, 1986). Es ist viel Arbeit geleistet worden, um die Sicherheit von Spirulina bei Einnahmewerten, die einen bedeutenden Teil der täglichen Nahrung ausmachen, zu garantieren (Boudene et al.,1976; Chamorro et al., 1988); Sautier und Trémolières, 1975; Til und Williems, 1971).
Während der letzten 15 Jahre erschien eine weitere cyanobakterielle Quelle von EZP, Aphanizomenon flos-aquae, auf dem Markt und macht heute einen wesentlichen Teil der Naturkostergänzungsindustrie in Nord Amerika aus. Gegenwärtig wird A. flos-aquae ausschließlich am Upper Klamath Lake, Klamath Falls, Oregon, natürlich angebaut und geerntet mit einer jährlichen Produktion von über 500 Tonnen an getrockneten Zellen. Tausende von Zeugnissen lassen von der täglichen Einnahme von AFA gesundheitsfördernde Wirkung erwarten (Cell Tech, unveröffentlicht; Kryow und Schaeffer, 1999).
Eine biochemische Basis für die gesundheitsfördernde Wirkung von AFA zeigte sich in den in vitro und in vivo Untersuchungen, die in vielen Arten von photosynthetischen einzelligen Mikroorganismen pharmakologisch aktive Wirkstoffe identifiziert haben. Zum Beispiel wurde bei gesunden Versuchspersonen innerhalb von 2 Stunden nach dem Verzehr von AFA eine 40%ige Zunahme der Bewegung umherwandernder natürlicher Killerzellen festgestellt (Manoukian et al., 1998). Natürliche Killerzellen beseitigen virusinfizierte und von Krebs befallene Zellen, indem sie den programmierten Zelltod der umgewandelten Zellen herbeiführen.
A.flos-aquae produziert Stoffe mit antibakterieller Wirkung (Ostensvik et al., 1998) und im Salmonella typhimurium Testsystem wurde auch mutationshemmende Wirkung nachgewiesen (Lahitova et al., 1994). Polysaccharide, Karrageene, Sulfolipide und andere aus photosynthetischen einzelligen Mikroorganismen isolierte Inhaltsstoffe zeigen antivirale Wirkung (Ayehunie, et al., 1998), einschließlich anti-HIV Wirkung in vitro (Schaeffer und Krylov, 1999). Über 100 wissenschaftliche Schriften untersuchen die tumorhemmende Wirkung von photosynthetischen einzelligen Meeres-und Süßwasser Mikroorganismen. So produziert zum Beispiel Anabaena flos-aquae Galactolipide mit tumorhemmender Wirkung (Shirahashi et al., 1996).
Photosynthetische einzellige Mikroorganismen, darunter AFA, sind eine ausgezeichnete Quelle für mehrfach ungesättigte Fettsäuren (Evans et al.,1996; Ikawa et al.,1994; Li et al., 1998). So hatten Ratten, die mit einer stark cholesterinhaltigen Diät gefüttert wurden, deutlich herabgesetzte Cholesterinwerte im Serum, nachdem ihrem Futter 21 Tage lang ein 5%iger Anteil der Cyanobakterie Nostoc commune zugesetzt worden war (Hori et al., 1994). Sano et al. (1988) ergänzten stark cholesterinhaltige Diäten mit aus Chlorella gewonnenen Glycolipid- oder Phospholipidanteilen. Beide Anteile hemmten den Anstieg der Serumlipidwerte und förderten die fäkale Ausscheidung von Steroiden (vor allem Cholesterin, sowie Desoxycholsäure und Lithocholsäure). Sie äußerten die Vermutung, daß diese Wirkung sowohl durch die Abnahme der Absorption der von außen aufgenommenen Steroide als auch durch die Zunahme der Gallentätigkeit verursacht worden sei und die Senkung des von der Diät bewirkten erhöhten Cholesteringehaltes im Serum herbeigeführt haben könnte. Die Einnahme von A. flos-aquae führt bei Ratten zu einer Abnahme der Cholesterin- und Triglyceridwerte im Blut (Kushak et al., 1999). Photosynthetische einzellige Mikroorganismen haben also in in vitro und in vivo Versuchen eine große Bandbreite von pharmakologischen Wirkungen auf eine Vielfalt von Arten, darunter auch auf den Menschen.
In den Vereinigten Staaten hat die Food and Drug Administration (USFDA, Behörde für Nahrungsmittel und Drogen ) entschieden, daß A. flos-aquae ein Nahrungsergänzungsmittel ist; daher ist es nicht wie eine Droge Vorschriften unterworfen, vorausgesetzt, daß keine Fälle von Gesundheitsschädigung angezeigt werden. AFA wird jedoch unter natürlichen Bedingungen geerntet und könnte daher Beimischungen der Spezies Microcystis enthalten, die starke Toxine der Microcystinfamilie erzeugt. Obgleich AFA keinen Vorschriften unterworfen ist, können die Höchstwerte zulässiger toxischer Verschmutzung wie z. B. durch Microcystin unter Bundes- und Bundesstaatsgesetz festgelegt werden. So hat vor allem das Landwirtschaftsministerium des Staates Oregon (State of Oregon Department of Agriculture, ODA) die zulässige Konzentration von Microcystin-LR in A. flos-aquae auf einen Höchstwert von 1.0 µg MCLR/g AFA festgelegt. Wegen eines Mangels an geeigneteren Daten stützte sich die Festlegung dieses zulässigen Höchstwertes auf eine Untersuchung, in der Mäusen täglich reines, in Wasser gelöstes Microcystin eingeflößt wurde
(Fawell et al., 1994). Die Wahl dieses Verfahrens zog nicht den möglichen Unterschied bei der Absorption, beim Zellstoffwechsel und in der Toxizität von Microcystin in Betracht, wenn es als Teil der AFA Matrix aufgenommen wird. Tatsächlich aber ist man Microcystin nur unter dieser Bedingung ausgesetzt. Eine umfassende Risikoanalyse (Schaeffer und Malpas, 1997) kam zu der Feststellung, daß der gesundheitsunschädliche Höchstwert bei einer Microcystinbelastung mehr als eine Größenordnung höher lag als der vom ODA vorgeschlagene.
Während der Vorbereitung der Risikoanalyse werteten Schaeffer und Malpas eine unveröffentlichte Untersuchung aus, die direkt die Sicherheitsfragen anspricht, die mit dem Verzehr von A. flos-aquae verbunden sind, das mit Mengen von MCLR verschmutzt ist, die viel höher liegen als der festgelegte Höchstwert von 1.0 p MCLR/g AFA. Jene Untersuchung beschreibt einen 1984 durchgeführten Fütterungsversuch, der die Wirkung des Verzehrs großer Mengen von A. flos-aquae auf die Größe, Vermehrung und Entwicklung neugeborener Mäuse erforschte, sowie die veränderten Blutwerte und die allgemeine Gesundheit erwachsener und neugeborener Mäuse. In Anbetracht der erst kürzlich durch das Oregon Department of Agriculture festgesetzten Höchstwerte, wurden die Ergebnisse von 1984 noch einmal im Lichte kurz zuvor durchgeführter Mengenanalysen betrachtet und förderten zutage, daß die 1984 verfütterten gefriergetrockneten A. flos-aquae Zellen einen Mittelwert von 20.0 +/- 5.0 µg MCLR/g AFA (Teile je Million Teile) enthielten. Dieser Wert ist ungefähr 20mal höher als die vorgeschlagene vorschriftsmäßige Höchstkonzentration, obgleich er nach der Einschätzung einer umfassenden Risikoanalyse über Microcystin in Trinkwasser und in Nahrungsergänzungsmitteln aus Algen innerhalb der Bandbreite einer unbedenklichen Dosierungsmenge liegt (Schaeffer und Malpas, 1997). Die hier wiedergegebenen Daten stammen aus der einzigen Untersuchung, die die Toxizität von MC bestimmt hat, wenn es als Verunreinigung eines cyanobakteriellen Nahrungsergänzungsmittels, das für den menschlichen Verbrauch vermarktet wird, in Erscheinung tritt.

Methoden

A. flos-aquae. In dieser Untersuchung benutzte Zellen wurden von einer Wasserleitung am südlichen Ende des Upper Klamath Lakes mit Hilfe einer Filtrierung durch Netzabschirmung geerntet. In den frühen Achtzigerjahren wurden die geernteten Zellen in einem fortlaufenden Prozeß gewaschen, gefroren und anschließend gefriergetrocknet. Dieser Prozeß entfernt keine anderen Algenarten aus A. flos-aquae, daher wird die Spezies Microcystis, die zufällig mit A. flos-aquae im Klamath Lake wächst, gleichfalls gefriergetrocknet.
Als diese Untersuchung 1984 durchgeführt wurde, standen keine empfindlichen Routineuntersuchungen für die Analyse und Mengenbestimmung von MC zur Verfügung und man begann gerade erst, die Toxikologie dieser Stoffe zu verstehen. Während des letzten Jahrzehntes veranlaßten die mit der Microcystintoxizität verbundenen Fragen die Entwicklung von empfindlichen analytischen Methoden, die in der Folgezeit für Routineuntersuchungen frischer und gefriergetrockneter Algenmengen benutzt wurden (Carmichael et al., 1999). AFA Proben von der Originaluntersuchung wurden bei Raumtemperatur fast 13 Jahre lang aufbewahrt und wurden kürzlich mit Hilfe des Enzymimmuntests ELISA (An und Carmichael, 1994), der Hochdruckflüssigkeitschromatographie HPLC (Lawton et al., 1994; Rivasseau et al., 1998) und einem Proteinphosphatase Analyseverfahren (PPIA) analysiert. Das PPIA Verfahren wurde entwickelt, nachdem MC als ein spezifischer und stark wirksamer Hemmstoff für die Proteinphosphatase 1 und 2A entdeckt worden war (Takai und Mieskes, 1991). Bei der Durchführung von PPIA wurde das Ausmaß der Farbbildung bei der Freisetzung von p-Nitrophenol aus p-Nitrophenolphosphat mit Hilfe eines Mikroplattenlesegerätes gemessen.

Versuchstiere. Siebzig (70) sechs Wochen alte Cox-Swiss Mäuse (Laboratory Supply Co., Indianapolis, IN) wurden willkürlich in sieben verschiedene Diätgruppen aufgeteilt. Jede Gruppe umfaßte zwei Käfige mit 5 Männchen bzw. 5 Weibchen pro Käfig. Zwei Käfige mit Männchen und zwei Käfige mit Weibchen wurden als Kontrollgruppen verwendet und wurden mit einer Diät ohne Nahrungsergänzungsmittel gefüttert. Die Mäuse wurden zu Beginn der Untersuchung mit einem Kreis von 1 mm Durchmeser am oberen linken oder rechten Ohrrand gekennzeichnet. Die Gruppen 2 bis 6 bekamen 65 bis 500mg AFA pro Tag als Nahrungsergänzung (Tabelle 1, siehe Anhang). Falls die
AFA Nahrungsergänzung für Mäuse toxisch war, sollte der Konzentrationswert,
der den Tod von 50 % der Mäuse verursachte, bestimmt werden.

Diät. Es wurde eine vollständige Diät geliefert (Rodent Blox; Wayne Pet Food, Continental Grain Company, Chicago,IL). Damit wurden die Mäuse nach ihrer Ankunft eine Woche lang gefüttert, bevor der Diät Zusätze beigemischt und bevor die Tiere gewogen wurden. Für die experimentelle Diät wurde dem Trockenfutter Rodent Blox Wasser zugesetzt und es wurde über Nacht im Kühlschrank eingeweicht. A. flos aquae (Cell Tech, Klamath Falls, OR) wurde mit dem feuchten Rodent Blox in den den verschiedenen AFA-Diät Stufen von Tabelle 1 entsprechenden Mengenverhältnissen gemischt. Das so verbesserte Futter wurde luftgetrocknet. In den ersten zwei Wochen des Versuchs betrug die tägliche Zuteilungsmenge 4 g Trockengewicht pro Maus; für den Rest des Versuchs wurde es dann auf 5 g Trockengewicht erhöht. Daher verzehrten die Mäuse ungefähr 91 g Trockenfutter in den ersten 21 Tagen und 201 g in 43 Tagen.

Wachstumsauswertung. Die erwachsenen Mäuse wurden alle 3 bis 4 Tage vormittags vor dem Füttern gewogen.

Auswertung der Organe und Blutwerte. Nach 21 Tagen wurden Mäuse von Gruppe 1 (Kontrollgruppe) und Gruppe 5 (250 mg AFA pro Tag) mit 0.25 ml einer im Verhältnis 1 : 10 verdünnten Lösung von Innovar eingeschläfert. Nieren, Leber und Milz wurden entfernt und die Gewichte der frischen Organe bestimmt. Die mit AFA gefütterten Mäuse der Gruppen 2 - 4 wurden ebenfalls getötet, aber die Gewebe wurden nicht untersucht. Nach 43 Tagen AFA-Fütterung wurden die übrigen Mäuse von Gruppe 6 (500 mg AFA pro Tag) und Gruppe 7 (Kontrollgruppe) anästhetisiert, die Nieren und die Leber wurden entfernt und das Gewicht der frischen Organe bestimmt. Die Organe wurden in neutral gepuffertem Formalin haltbar gemacht und in Glycohnethacrylat eingelagert. Teile von ihnen wurden mit Hematoxalin-Eosin Lösung für die mikroskopische Auswertung gefärbt.

Auswertung einer Aufzuchtuntersuchung. Fünf männlich-weibliche Paare von Kontrollmäusen (Gruppe 7) wurden in getrennte Käfige gesetzt. Fünf männlich-weibliche Paare von Gruppe 6, die mit 500 mg AFA pro Tag gefüttert worden waren, wurden gleichfalls in getrennten Käfigen untergebracht. Die Zuchttiere wurden periodisch während des ganzen Experimentes gewogen. Nach dem Werfen wurde die Anzahl der Jungen in jedem Wurf festgestellt. Aus den Würfen wurden entsprechend dem Standardverfahren je acht Junge ausgewählt, um das Wachstum der Nachkommenschaft auszuwerten.

Ergebnisse

Sechs Proben von dem im Fütterungsversuch von 1984 benutzten AFA wurden mit Hilfe von ELISA, HPLC und PPIA auf MCLR hin untersucht (1997 - 1999). Für jede Probe wurden an jedem von sechs verschiedenen Terminen Analysen durchgeführt. Die MCLR Werte lagen zwischen 11 und 24.7 µg MCLR/g AFA und hatten einen Durchschnittswert von 20.0 +/- 5.0 µg MCLR/g AFA. Dies entspricht einer durchschnittlichen Belastung von 333 gg MCLR/kg pro Tag für die höchste MC Belastungsstufe (Tabelle 2, siehe Anhang).
Keine Maus starb oder zeigte irgendwelche Anzeichen von Vergiftungserscheinungen. Es gab keine erkennbaren physiologischen Veränderungen bei Mäusen, die 21 oder 43 Tage lang eine Nahrungsergänzung mit AFA in einer der angegebenen Dosierungshöhen erhalten hatten; Felleigenschaften, Augenfarbe, Schwanzfarbe und Aktivität wurden nicht beeinflußt. Subjektive Beobachtungen zeigten sogar ein günstigeres Temperament und eine größere gegenseitige Verträgichkeit unter den mit AFA gefütterten Mäusen.

Am Tage 0 unterschied sich das durchschnittliche Körpergewicht der Mäuse in den verschiedenen Gruppen nicht (Variantenanalyse). Nach 21 Tagen waren die Wachstumsraten sowohl der Weibchen (Tabelle 3, siehe Anhang) als auch der Männchen (Tabelle 4, siehe Anhang) bei allen Mengenabstufungen der AFA Zufütterung (65, 125, 185, 250 und 500 mg AFA pro Tag) statistisch gleich (Co-Variantenanalyse) mit denen der Mäuse, die mit einer Kontrolldiät gefüttert wurden. Das Durchschnittsgewicht der Weibchen aller Gruppen außer der 250 mg Gruppe nahm nach 3 Versuchstagen ab, aber stieg danach wieder an. Der Effizienzquotient des Futters wird durch den Futterverbrauch pro Einheit der Gewichtszunahme festgelegt. Weder für die Weibchen noch für die Männchen wurde dieser Quotient signifikant durch die AFA Zufütterung beeinflußt (nicht belegt). Bei der Autopsie waren die inneren Organe der mit AFA behandelten Mäuse und der der Kontrollgruppen identisch was die allgemeine Erscheinung und das mit dem Organ verbundene Fett angeht. Nach 21 Tagen bestand eine weitgehende Übereinstimmung der Milzgröße (Tabelle 5, siehe Anhang). Am Ende der Periode von 43 Tagen wurde die Milz nicht entfernt, aber es wurden keine Abnormitäten in Größe oder Erscheinung wahrgenommen.
Es wurden mikroskopische Untersuchungen von Leber, Nieren und Milz durchgeführt und keine histologischen Unterschiede zwischen den Geweben der mit AFA gefütterten Gruppen und der Kontrollgruppen festgestellt. Die Organe der mit A. flos-aquae gefütterten Tiere waren nach 21 bzw. 43 Tagen frei von Tumoren, faserigen Stellen und anderen strukturellen Abnormitäten.
Das mittlere Organgewicht und das Verhältnis zwischen Organ- und Körpergewicht nach 21 Tagen werden in Tabelle 5 (siehe Anhang) wiedergegeben. Körper- und Organgewicht, sowie das Verhältnis zwischen Organ- und Körpergewicht nach 43 Tagen werden in Tabelle 6 (siehe Anhang) wiedergegeben und in Abb. l (siehe Anhang) graphisch dargestellt. Das Verhältnis von Organ- und Körpergewicht wurde für Männchen und Weibchen getrennt analysiert in wiederholten Gewebeuntersuchungen mit zwei Versuchsfaktoren, AFA-Behandlung (Kontrollgruppen im Vergleich zu mit AFA behandelten Gruppen) und Gewebe (Leber, Nieren, Milz). Die Auswertung von Tabelle 5 und 6 und von Abb. 1 zeigte, daß das Verhältnis des Organ/Körpergewichtes zwischen den verschiedenen Gruppen nach 21 und 43 Tagen unterschiedlich war, aber nicht zwischen den Kontrollund den mit AFA behandelten Gruppen beider Geschlechter.
Die trächtigen Weibchen, an die die Diät mit dem A. flos-aquae Zusatz verfüttert wurde, zeigten keine Vergiftungserscheinungen. Es gab keine signifikanten Unterschiede in der Größe des Wurfes und dem Gewicht der Neugeborenen (Tabellen 7 und 8, siehe Anhang). Außerdem blieben das Überleben und das Wachstum des Wurfes davon unbeeinflußt, daß die Mutter während der Trächtigkeit und während des Säugens mit 500 mg AFA Nahrungszusatz gefüttert worden war. Ebensowenig beeinträchtigten 333 µg MCLR pro kg Körpergewicht und Tag die Fortpflanzungsfähigkeit bei erwachsenen Mäusen oder schädigten sie das Wachstum der Nachkommenschaft.

Auswertung

Die Stabilität von trockener gefrorener Algenmatrix ist unbekannt. "Chemischer Abbau von Microcystin-LR scheint kein günstiger Weg zu sein, um Microcystin aus dem Wasser zu entfernen, da die Konzentration dieses Giftes sich über eine Periode von 39 Tagen unter einer Vielzahl von pH und Licht Einflüssen nicht abbaute" (Cousins and Watts, 1992) Die Einwirkung von UV Licht auf Microcystin mit Wellenlängen um dessen Absorptionsmaximum führte dagegen zu einem schnellen Abbau (Tsuji et al., 1995). Der Abbau hing von der Intensität des Lichtes ab: Der Halbwert von MCLR bei einer UV Bestrahlung von 147 µW/cm2 betrug 10 Minuten und bei einer Bestrahlung von 2550 µW/cm2 war das Gift nach 10 Minuten vollkommen abgebaut. Die Proben von A.flos-aquae von 1984, die auf MCLR hin untersucht worden waren, wurden in einem versiegelten, vor Sonnenlicht geschützten Behälter aufbewahrt, so daß man davon ausgehen kann, daß der chemische Abbau gering war. Folglich stellt die hier wiedergegebene MCLR Konzentration den Minimalwert des 1984 vorhandenen MCLR Gehaltes dar.
Die Verhaltensänderungen, die bei diesen Mäusen beobachtet wurden, stimmen mit den Berichten von Ärzten über verbessertes Verhalten und verbesserte Konzentrationsfähigkeit bei Menschen überein (Krylow und Schaeffer, in Vorbereitung). Elektroencephalogramme beim Menschen unterscheiden sich vor und nach der Einnahme von A. flos-aquae (Valencia et al., 1999) bei 1/300 der Menge (g/kg), die den Mäusen verabreicht wurde.
Die Leber funktioniert als ein entgiftendes Organ und erfährt oft ausgedehnte histologische Veränderungen und Sekretveränderungen, wenn dem Körper toxische Substanzen zugeführt werden. Es ist bekannt, daß die Einwirkung von toxischen MCLR Konzentrationen insbesondere die Leber angreift (Beasley et al., 1989; Kaya, 1996) Khan et al., 1996; Wickstrom et al., 1995). Die Niere ist gleichfalls ein extrem empfindliches Organ, bei dem strukturelle und funktionelle Veränderungen schnell die Wirkung toxischer Substanzen, einschließlich MCLR, in der Nahrung wiederspiegeln (Khan et al., 1996). Die Tatsache, daß die Leber und die Nieren erwachsener Männchen und Weibchen, die einer Microcystinbelastung ausgesetzt waren, weder nach 21 noch nach 43 Tagen beeinträchtigungen aufwiesen, zeigt, daß selbst sehr große Mengen von A. flos-aquae mit einem durchschnittlichen Anteil von 20.0 +/- 5.0 µg MCLR/g keine strukturellen (Organ) oder funktionellen (Wachstum, Vermehrung) Vergiftungserscheinungen bewirkte.
Die Tatsache, daß es keine Wachstumsstörungen oder gesundheitsschädigenden Wirkungen bei erwachsenen Mäusen gab, die große Mengen von A. flos-aquae zu sich nahmen, entspricht nicht dem, was bei der Verwendung anderer Quellen von einzelligen Proteinen oder Algenarten, die kein MCLR enthalten, beobachtet wurde. Man fand zum Beispiel heraus, daß die Spezies S bei hohen dietätischen Dosierungen das Wachsum herabsetzt (Becker, 1986). Chlorella hat schwer verdauliche und allergiefördernde Eigenschaften (Tiberg et al., 1995). Scenedismus, eine grüne Alge, ist eine gute Quelle für Proteine (45 - 55%) (Becker und Venkataraman, 1980) und Carotenoide (Walz und Brune, 1980), aber andere Untersuchungen führten zu der Vermutung, daß Scenedesmus auch toxische Wirkung haben könnte (Becker, 1996; Richmond, 1990)
Es ist genau belegt, daß die kindliche Entwicklung während der Schwangerschaft und kurz nach der Geburt sehr empfindlich auf die Einwirkung toxischer Chemikalien reagiert (Hansen, 1999). Jedoch hatte A. flos-aquae in Verbindung mit der Auswirkung von 333 gg MCLR pro kg Körpergewicht am Tag keinen Einfluß auf die Entwicklung des Fötus oder des Neugeborenen. Diese Untersuchung der Organfunktion und der Trächtigkeit bei erwachsenen Mäusen sowie des Wachstums und der Organfunktion bei Föten und neugeborenen Mäusen erwies, daß die Einnahme von A. flos-aquae in großen Mengen und in Zusammenwirkung mit MCLR keinen wahrnehmbaren schädlichen Einfluß ausübte.
Was die Auswirkung von MCLR angeht, sind diese Resultate vergleichbar mit denen der Entwicklungsstudie mit dreizehnwöchiger Dosierungswiederholung über die Fawell et al. (1994) berichten. In dieser Entwicklungsstudie wurde Gruppen von 26 zeitgleich gepaarten weiblichen Mäusen einmal täglich vom 6. bis 15. Tag der Trächtigkeit eine Dosis MCLR eingeflößt. Sieben der Weibchen, denen 2000 µg MCLR pro kg Körpergewicht am Tag eingeflößt wurde, starben und 2 wurden aus Gründen der Humanität vor Ende des Experimentes getötet. Ein Tier, dem 200 µg MCLR pro kg Körpergewicht am Tag verabreicht wurde, starb aus nicht wiedergegebenen Gründen. In der Untersuchung stimmten die Gewichtszunahmen bei den überlebenden Weibchen aller Gruppen, die eine Dosis Microcystin bekamen, mit denen der Weibchen in den Kontrollgruppen überein.
Das ODA gab im Oktober 1997 Vorschriften heraus (Statutory Reference 603-25-190), die sich auf die Untersuchung von Fawel et a1. (1994) stützten, die gesundheitsunschädliche Höchstwerte von 40 gg MCLR pro kg Körpergewicht am Tag vorschlugen. Auf diesen Sicherheitswert schlug das ODA Unsicherheitsfaktoren auf für die Übertragung der Untersuchungsergebnisse bei Tieren auf den Menschen ( x 10 ), für Empfindlichkeit ( x 10), und einen aus mehreren Faktoren zusammengesetzten Unsicherheitsfaktor, der subchronische auf chronische Übertragung, Beweise für tumorfördernde Eigenschaften, Datenmangel wie z. B. das Fehlen einer Untersuchung über Fortpflanzung (x 10 ) umfaßte. Der allgemeine Sicherheitsfaktor war tausend.
Schaeffer und Malpas (1997) führten eine umfassende Risikoanalyse für MCLR in Trinkwasser durch, die alle verfügbaren Daten aus Kurzzeit-und Langzeituntersuchungen benutzte. Ihr zulässiger Höchstwert wurde aus Daten von verschiedenen Arten und Stämmen, aus dem Verlauf von Dosierungsversuchen und biologischen Endpunkten abgeleitet. Sie folgerten, daß das Risikomanagement für MCLR einen NOAEL von 500 µg MCLR pro kg Körpergewicht am Tag erfordert. Für einen 60 kg schweren Erwachsenen, der täglich 2 Liter Wasser verbraucht, beträgt der geschätzte zulässige Höchstwert von MCLR bei der Anwendung eines Sicherheitsfaktors von 1000 15 µg MCLR/L oder 30 gg MCLR pro Tag.
Der vorliegende Dosierungsversuch wurde ein Jahrzehnt bevor es ernsthafte Bedenken über die Aufnahme von Microcystmen über AFA-Nahrungsergänzungsmittel gab, durchgefihrt und war entsprechend der klassischen Vorschriften für die Untersuchung von Nahrungsmitteln sowohl auf positive als auch negative Auswirkungen auf Gesundheit, Fortpflanzung, Wachstum und Entwicklung hin angelegt. Dennoch ist die Untersuchung äußerst relevant für die gegenwärtigen Bedenken, weil die in diesem Versuch benutzten Mäuse einer Belastung durch Microcystinmengen ausgesetzt wurden, die die gültigen Standardwerte für Microcystine in A. flos-aquae (Oregon Statutory Reference 603-25190) weit überschreiten. Aus den Daten dieses Versuches ergibt sich ein NOAEL von 333 µg MCLR pro kg Körpergewicht am Tag, der mit veröffentlichten NOAEL Werten übereinstimmt (Falconer et al., 1994; Fawell et al., 1994; Schaeffer und Malpas, 1997).

Der vom ODA benutzte Sicherheitsfaktor kann auf diesen Versuch angewandt werden. Obgleich dieser Versuch nur halb solange dauerte wie der von Fawell et al. (1994), benutzte er ein ähnliches tierisches Modell und demonstrierte, daß 333 µg MCLR pro kg Körpergewicht am Tag für die Fortpflanzungsfunktionen kein Risiko bedeutet. Zudem handelte es sich um einen normalen Fütterungsversuch, bei dem die Tiere nicht zwangsweise gestopft wurden, was die Leberfunktionen beeinträchtigen kann (Dr. Philip F. Solter, University of Illinois, persönliches Gespräch, 1997). Außerdem wurde in diesem Versuch kein reines in Wasser gelöstes Gift benutzt, sondern die Tiere wurden einer Belastung durch Microcystine in derselben Matrix ausgesetzt, die für den menschlichen Gebrauch vermarktet wird. Wenn man einen Sicherheitsfaktor von 1000 auf den NOAEL des gegenwärtigen Versuches von 333 µg MCLR pro kg Körpergewicht am Tag aufschlägt, errechnet sich für ein durchschnittliches menschliches Körpergewicht von 60 kg (entsprechend dem ODA) der maximal zulässige Höchstwert ( oder die tägliche Aufnahmetoleranz) von Microcystinen als 20.0 µg MCLR pro Tag.
Möglicherweise enthält die Matrix eine Schutzfunktion gegen die Vergiftung durch Microcvstin. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, in Versuchen das Risiko von MCLR in vermarktetem A. flos-aquae unter Verwendung der cyanobakteriellen Matrix einzuschätzen statt das Risiko von MCLR als reines Gift. So ist z. B. das Flavonolignan Silymarin ein Membranantioxydans, das gegen Microcystin-LR schützt (Hermansky et aL,1991; Mereish und Solow, 1990; Mereish et al., 1991; Solow et al., 1990). A flos-aquae enthält Silymarin in einer Konzentration von 80 - 200 µg/g. Mereish et al. (1991) fanden heraus, daß eine einzige Dosis von Silymarin die tödliche Wirkung und die pathologischen Veränderungen völlig aufhob und die durch Microcystin-LR Vergiftung verursachte Mengenveränderung von Blutenzymen herabsetzte. Mereish und Solow (1990) fügten einer Zellkultur 1 µM MCLR hinzu und analysierten die Zellschäden an der Menge der zellulären ('a C) Adeninnucleotide, an der Freisetzung von Lactatdehydrogenase in das Medium und an dem Ausmaß, in dem sich Hepatocyten von den monomolekulären Schichten ablösten. Silymarin ( 25 - 200 µM) reduzierte die Menge der ausgelösten Kennzeichen und die Zellablösung bei mit Microcystin-LR behandeltem Brunnenwasser. Außerdem verhinderte es morphologische Deformationen und Zellablösungen. Hermansky et al. (1991) entdeckten, daß die Verabreichung von 400 mg pro kg Körpergewicht von Silymarin in 30 %iger Glycerinlösung 24 Stunden vor der einmaligen MCL Einnahme weibliche Mäuse vor dem Tod durch eine Dosis von 100 ßg MCLR pro kg Körpergewicht (tödliche Dosis 100) schützte. Nach diesen Untersuchungen könnte der Silymaringeh 1 in A flos-aquae einen weiteren täglichen Schutz gegen kleinere Mengen von MCLR bieten und ein endogenes und natürliches zusätzliches Sicherheitselement darstellen.
Ungefähr 70 % der Verbraucher von Cell Tech A. flos-aquae Produkten verzehren weniger als 2 g A. flos-aquae pro Tag mit einem Durchschnittswert von 1.7 +/- 0.6 g A. flos-aquae pro Tag (Mittelwert +/- Standardabweichung; Cell Tech, unveröffentlichter Überblick). Für die 30 % der Verbraucher, die mehr als 2 g A. flos-aquae pro Tag verzehren, beträgt der Mittelwert +/- Standardabweichung 2.3 +/0.3 g A. flos-aquae pro Tag. Weniger als 2% der Verbraucher verzehren mehr als 3 g A. flos-aquae pro Tag. Wenn man daher einen durchschnittlichen täglichen Verbrauch von 2 g A. flos-aquae annimmt, wäre für MCLR ein zulässiger Höchstwert von 10.0 µg MCLR/g A. flos-aquae vertretbar. Dieser Wert ist zehnmal höher als der vom ODA vorgeschlagene Richtwert (1997), der seinen Standard auf Daten aus Versuchen mit Zwangsfütterung gründete (Fawell et al., 1994), welches kein relevanter Weg für eine Microcystin-Aufnahme ist. Diese Untersuchung füllt eine Lücke im Prozeß der Gewinnung von Sicherheitsbestimmungen, indem sie relevante Daten über Microcystin als toxischem Bestandteil von vermarktetem A. flos-aquae liefert.

Schlussfolgerung

Der Fütterungsversuch wurde durchgeführt ungefähr ein Jahrzehnt bevor es irgendwelche ernsthaften Bedenken über den Verzehr von Microcystinen als Bestandteil von A. flos-aquae Nahrungsergänzungsmitteln gab. Die Untersuchung war entsprechend dem klassischen Muster für Nahrungsmitteluntersuchungen über positive und negative Auswirkungen auf Gesundheit, Fortpflanzung, Wachstum und Entwicklung konzipiert. Die Tatsache, daß in dem für diesen Versuch benutzten AFA Microcystine enthalten waren, machten ihn jedoch zu einem guten Werkzeug für die Bestimmung eines gesundheitsunschädlichen Höchstwertes für Microcystin als toxischer Bestandteil von A. flos-aquae Produkten. Dieses ist der einzige Versuch, der mit Microcystinen durchgeführt wurde, die als natürlicher Teil der als Naturkostergänzung verwendeten A. flos-aquae Matrix vorkommen, und für die der Staat Oregon einen Richtwert festgesetzt hat. Ein klarer NOAEL von 333 µg A. flos-aquae pro kg Körpergewicht am Tag wurde bestimmt, und davon ausgehend ergaben die vom ODA durchgeführten Berechnungen zur Risikoanalyse einen Sicherheitswert von 10.0 µg MCLR/g für MCLR als toxischen Bestandteil von A. flos-aquae Produkten.

Danksagungen

Der originale Fütterungsversuch, der 1984 durchgeführt wurde, wurde von Cell Tech. finanziert. Die in dieser Risikoanalyse benutzten Daten über Microcystin wurden von Dr. Christian Drapeau (Cell Tech) zur Verfügung gestellt. Die Autoren danken Cell Tech für die finanzielle Unterstützung, die die Veröffentlichung dieses Artikels möglich machte und Dr. Christian Drapeau außerdem für die hilfreichen Kommentare zum Entwurf des Manuskriptes.

Literaturangaben

An, J. S., and Carmichael, W. W. (1994) Use of a colorimetric protein phosphatase inhibition assay and enzyme linked immunosorbent assay for the study of microcystins and nodularins. Toxicon 32, 1495-1507.
Ayehunie, S., Belay, A; Baba, T. W., and Ruprecht, R. M. (1998). Inhibition of HIV-1 replication by an aqueous extract of Spirulina platensis (Arthrospira platensis). J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 18,7-12.
Beasley, V. R., Lovell, R. A., Dahlem, A. M., Haschek, W. M., and Hooser, S. B. (1989 Cyclic peptide hepatotoxins from cyanobacteria (blue-green algae): In Handbook of Natural Toxins (R. F. Keeler and A. T. Tu, Eds.), pp. 459-495. Dekker, New York.
Becker, E. W. (1986). Nutritional properties of microalgae: potentials and constraints. In Handbook of Microalgal Mass Culture (Richmond A., Ed.), pp. 339-419. CRC, Boca Raton, FL.
Becker, E. W, and Venkataraman, L. V. (1980). Production and processing of algae in pilot plant scale experiences of the Indo-German project. In Algal Biomass, Production and Use (G. Shelef and C. J. Soeder, Eds.), pp. 35-50. Elsevier/North Holland Biomedical Press, Amsterdam.
Boudene, C., Collas, E., and Jenkins, C. (1976). Recherche et dosage de divers toxiques mineraux dans les algues spirulines de differentes origines, et evaluation de la loxicite a long terme chez le rat d'un lot d'algues Spirulines de provenance mexicaine. Ann. Nutr. Alim. 30, 577-588.
Carmichael, W. W., Anderson, D. M., and Drapeau, C. (1999). Harvesting and quality control of Aphanizomenon flos-aquae from Klamath Lake, Oregon for human dietary use. blanuscript submitted.
Chamorro, G. A., Herrera, G., Salazar, M., Salazar, S., and Ulloa, V. (1988), Etude de la loxicite chronique de la Spiruline chez le rat. Met et Nutr, 24, 104-106 80

SCHAEFFER, MALPAS, AND BARTON
Ciferri, O. (1983). Spirulina, the edible microorganism. Microbiol. Rev. 47, 551-578.
Clement, G. (1975). Production et constituents caracteristiques des algues Spirulina platensis et maxima. Ann. Nutr. Alim. 29, 477-488. .
Cousins, I., and Watts, C. D: (1992), An investigation of the Degradation of Microcystin-L& Report No. FR0292. Foundation for Water Research (FWR), Bucks, England.
Evans, A. M., Li, D., Jones, A., Games, M. P., Games, D. E., Gallon, J. R., and Walton, T. J. (1996). Analysis by gas chromatography-mass spectrometry of the fatty acid composition during temperature adaptation in Aphanizomenon fios-aquae, a diazotrophic cyanobacterium from the Baltic Sea. Biochem. Soc. Trams. 24, 4755.
Falconer, I. R, Burch, M. D, Steffensen D. A., Choice, M., and Coverdale, O. R. (1994). Toxicity of blue-green alga (cyanobacterium) Microcystis aeruginosa in drinking water to growing pigs, as an animal model for human injury and risk assessment. Environ. Toxicol. Water Qual. 9, 131-139.
Farrar, W. V. (1966). Tecuitlatl: A glimpse of Aztec food technology. Nature (London) 211, 341-342.
Fawell, J. K., James, C. P., and James, H. A. (1994). Toxins from Blue-Green Algae: Toxicological Assessment of Microcystin-LR and a Method for its Determination in Water. Foundation for _ Water Research, Marlow, Bucks, England.
Hansen, L. G. (1999). The ortho Side of PCBs: Occurrence and Disposition. Kluwer Academic, Norwell, MA.
Hermansky, S. J., Stohs, S. J., Eldeen, Z. M., Roche, V. F., and Mereish, K. A. (1991). Evaluation of potential chemoprotectants against microcystin-LR hepatotoxicity in mice. J. Appl. Toxicol. 11, 65-73. Hori, K., Ishibashi, G., and Okita, T. (1994). Hypocholesterolemic effect of blue-green alga, ishikurage (Nostoc commune) in rats fed atherogenic diet. Plant Foods Hum. Nutr. 45, 63-70.
Ikawa, M., Sasner, J. J., and Haney, J. F. (1994). Lipids of cyanobacterium Aphanizomenon fios-aquae and inhibition of Chlorella growth. J. Chem. Ecol. 20, 2429-2436.,
Kaya, K. (1996). Toxicology of microcystins. In Toxic Mycrocystis (M. F. Watanabe, K.-I. Harada, Carmichael W.W., and Fujiki H., Eds.), pp. 175-202. CRC Press, Boca Raton, FL.
Khan, S. A., Wickstrom, M. L., Haschek, W. M., Schaeffer, D. J., Ghosh, S., and Beasley,V. R. (l996). Microcystin-LR and kinetics of cytoskeletal reorganization in hepatocytes, kidney cells and fibroblasts. Natural . . Toxins 4, 206-214.
Kushak, R., Drapeau, C., van Cott, E., and Winter, H. (1999). Blue-green alga Aphanizomenon fios-aquae as a source of dietary polyunsaturated fatty acids and a hypocholesterolemic agent. J. Amer. Nutraceut. Assoc. (submitted).
Kyrlov, V. S., Drapeau, C., Hassell, C., Millman, J. D., Strickland, J. W, Jr, and Schaeffer, D. J. (1999). Retrospective epidemiological study using medical records to determine which diseases are improved by Aphanizomenon fios-aquae supplements. Med. Hypotheses (submitted). Lahitova, N., Doupovcova, M., Zvonar, J., Chandoga, J, and Hocman, G. (1994). Antimutagenic properties of fresh-water blue-green algae. Folia Microbiol. 39, 301-303..
Lawton, L., Edwards, C., and Codd, E._ (1994). Extraction and high- . performance liquid chromatographic method for the, determination of microcystins in raw and treated waters. Analyst 1191525-1530:
Li, R., Yokota, A., Sugiyama, J., Watanabe, M., Hiroki, M., and Watanabe, M. M. (1998) Chemotaxonomy of planktonic cyanobacteria based on non-polar and 3-hydroxy fatty acid composition. Phycol. Res. 46, 21-28.
Manoukian, R., Citton, M., Huerta, P., Rhode, B., Drapeau, C., and Jensen, G. S. (1998). Effects of the blue-green algae Aphanizomenon fios-aquae (L.) Ralphs on human Natural Killer cells. In Phytoceuticals: Examining the Health Benefits and Pharmaceutical Properties of Natural Antioxidants and Phytochemicals, IBC Library Series, 1911, pp. 233-241.
Til,-H. P., and Williems, M. (1971). Sub-chronic (90 day) Toxicity Study with Dried Algae (MJ in albino rats. Report No. R 3352 TNO, Zeist, Holland.
Mereish, K. A., Bunner, D. L., Ragland, D. R., and Creasia, D. A. (1991). Protection against microcystin-LR-induced hepatotoxicity by Silymarin: Biochemistry, histopathology, and lethality. Pharm. Res. 8, 273-277.
Mereish, K. A., and Solow, R. (1990). Effect of antihepatotoxic agents against microcystin-LR toxicity in cultured rat hepatocytes. Pharm. Res. 7,256-259.
Ostensvik, O., Skulberg, O. M., Underdal, B., and Hormazabal, V. (1998). Antibacterial properties of extracts from selected planktonic freshwater cyanobacteria-A comparative study of bacterial bioassays. J. Appl. Microbiol. 84, 1117-1124.
PAG (Protein Advisory Group) (1974). PAG Standard No. 15. Nutritional and safety aspects of new sources of proteins for feeding animals. PAG Bull. IV(3), 12.
Richmond, A. (1990). Handbook of Microalgal Mass Culture. CRC Press, -Boca Raton, Florida.
Shirahashi, H., Morimoto, T., Nagatsu, A., Murakami, N., Tatta, K., Sakakibara, J., Tokuda, H, and Nishino, H. (1996). Antitumor-promoting activities of various synthetic 1-0-acyl-3-0-(6'-O-acyl-beta-D-galac-opyranosyl)-sn-glycerols related to natural product from freshwater cyanobacterium Anabaena fios-aquae f. fios-aquae. Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 44,1404-1406.
Rivasseau, C., Martins, S., and Hennion, M. (1998). Determination of some physicochemical parameters of microcystins (cyanobacterial toxins) and trace level analysis in environmental samples using liquid chromatography. J. Chromatogr. A 799, 155-169.
Sano, T., Kumamoto, Y, Kamiya, N., Okuda, M., and Tanaka, Y. (1988). Effect of lipophilic extract of Chlorella vulgaris on alimentary hyperlipidemia in cholesterol-fed rats. Artery 15, 217-224.
Sautier, C., and Trémolières, J. (1975). Valeur alimentaire des algues Spirulines chez l'homme. Ann. Nutr. Alim. 30, 517-534.
Schaeffer, D. J., and Krylov, V. S. (1999). Anti-HIV activity of extracts and compounds from algae and cyanobacteria. Ecotox. Environ. Saf. (Accepted for publication).
Schaeffer, D. J, and Malpas, P. B. (1997). Risk Assessment for Microcystins in Drinking Water. EcoHealth Research, Inc., Champaign, IL.
Solow, R., Mereish, D. A., Anderson, G. W., and Hewetson, J. (1990). Effect of microcystin-LR on cultured rat endothelial cells. Med. Sci. Res. 18, 241-244.
Takai, A., and Mieskes, G. (1991). Inhibitory effect of okadaic acid on the p-nitrophenyl phosphate phosphatase activity of protein phosphatases. Biochem. J. 275, 233-239. - ,
Tiberg, E., Dreborg, S., and Bjorkstein, B. (1995). Allergy to green algae (Chlorella) among children. J. Allergy Clin. Immunol. 96, 257-259.
Tsuji, K., Watanuki, T, Kondo, F., Watanabe, M. F., Suzuki, S., Nakazawa, H., Suzuki, M., Uchida, H., and Harada, K.1. (1995). Stability of microcystins from cyanobacteria. II. Effect of UV light on decomposition and isomerization. Toxicon 33, 1619-1631.
Valencia, A. D., and Walker, J. E. (1999). A multi-axial treatment paradigm for mild traumatic brain injury to achieve reparative functional meteplasticity. 3rd World Congress on Brain Injury, Quebec City, June 12-17, 1999,S231.
Walz, O. P., and Brune, H. (1980). Studies on some nutritive effects of the green algae Scenedesmus acutus with pigs and broilers. In Algae Biomass, Production and Use (G. Shelef and C. J. Soeder, Eds.), pp. 733-744. Elsevier/North Holland Biomedical Press, Amsterdam.
Wickstrom, M. L., Khan, S. A., Haschek-Hock, W. M., Wyman, J. F., Eriksson, J. E., Schaeffer, D. J., and Beasley, V. R. (1995). Alterations in microtubules, intermediate filaments, and microfilaments induced by microcystin-LR in cultured cells. Toxicol. Pathol. 23, 326-337.

Anhang: Abbildungen und Tabellen 324KB